ネクロトーシスを調節する分子機構について考える

Cosmo Bio would like to acknowledge and thank the Prosci Inc. for providing “Insights into the Molecular Mechanisms Regulating Necroptosis” information presented here.

はじめに

制御された細胞死の一つの形態であるネクロトーシス（ネクロプトーシス、Necroptosis）は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスに関与していることが明らかになっており、近年注目を集めています。ネクロトーシスはプログラムされた細胞死の中でも特殊な形態であり、さまざまなシグナル伝達経路、メディエーター、免疫応答によって厳密に制御されています。インターフェロン-γ (IFN-γ) およびトール様受容体 4 (TLR4) のシグナル伝達経路は、マクロファージのネクロトーシスの重要な調節因子として同定されています。ネクロトーシスを支配する根本的な分子機構を理解することは、免疫応答や疾患の発症におけるネクロトーシスの役割を解明するために不可欠です。

本稿では、受容体相互作用プロテインキナーゼ (RIPK) に関連するネクロプトーシスを支配する分子機構に関する最近の知見を紹介します。

RIPK3 と MLKL: IFN-γ 誘発性 PS 曝露と壊死症における重要な役割

Chenらが2019年に発表した論文 : ”Interferon-γ induces the cell surface exposure of phosphatidylserine by activating the protein MLKL in the absence of caspase-8 activity”では、マウス胎児線維芽細胞(MEF)におけるIFN-γ誘導性PS曝露でのRIPK3の役割に関する研究成果を紹介しています。著者らは、RIPK3がMEFにおけるPS曝露に必要であることを証明しました。同時に、RIPK3により活性化されるmixed lineage kinase domain-like protein(MLKL)タンパク質のオリゴマー化は、IFN-γ誘導性のPS曝露およびMEFにおけるネクロトーシス性の細胞死に不可欠ということが報告されました(1)。

ネクロトーシスは、受容体に結合する腫瘍壊死因子 (TNF) などの誘導因子によって引き起こされる、非アポトーシス性の制御されたネクローシスです (2)。これには RIPK1 および RIPK3 の活性が必要であり、MLKL の活性化によって媒介されます(3) 。インターフェロン (IFN) は、I 型と II 型の 2 つのグループに分類され、両方のタイプの IFN が多数の特異的な遺伝子の発現を誘導します (4,5)。

この論文では、RIPK3により再構築されたiC8KO MEF(不死化カスパーゼ8ノックアウトマウス由来胚線維芽細胞：外生的にRIPK3が発現している）において、RIPK3はIFN-γが誘導するPS曝露とネクロトーシスに必要であること、MLKLがリン酸化され、IFN-γ処理したネクロトーシス前のMEFではオリゴマー化することが報告されています。さらに、IFN-γ 誘導性の PS 曝露とネクロトーシスは、さまざまな細胞において RIPK1、RIPK3、および MLKL に依存します。

この研究では、誘導されたPS曝露におけるRIPK3、MLKL、IFN-γおよびMEFにおけるネクロトーシスの役割を明らかにし、IFN-γ誘導性のPS曝露の根底にあるメカニズムと、この過程におけるMLKLの潜在的な機能について考察しています。

ネクロトーシス、サイトカインシグナル伝達および免疫応答に対するRIPK1K45A変異の影響：炎症および感染症感受性の状況変化

Shutinoskiらが2016年に発表した論文 “K45A mutation of RIPK1 results in poor necroptosis and cytokine signaling in macrophages, which impacts inflammatory responses in vivo” では、マクロファージにおけるネクロトーシスと、サイトカインシグナル伝達におけるRIPK1のキナーゼドメインの役割およびそれによるin vivoでの炎症反応への影響について検討されています。また、マクロファージのネクロトーシスおよび炎症反応の活性化に対するRIPK1のK45A変異の影響も評価しています(7)。

RIPK1はネクロトーシスの誘導に不可欠であり、様々なToll様受容体(TLR)とサイトカイン受容体(8,9)の関与によって引き起こされます。RIPK1のリン酸化は、ネクロトーシスの発生に必要なRIPK1とRIPK3の相互作用を引き起こします(10)。RIPK3は、特定の条件でRIPK1とは無関係にネクロトーシスを誘導することもあります(11)。さらに、MLKLタンパク質は、リン酸化によりオリゴマー化及び細胞膜への移行が生じ、細胞の完全性が損なわれるため、ネクロトーシスにも不可欠です(12)。このように、RIPK1とMLKLタンパク質は、それぞれの相互作用とリン酸化を通じてネクロトーシスの誘導に重要な役割を果たしています。

この研究では、RIPK1^K45A系統のマウスを用いて、マクロファージのネクロトーシスの亢進におけるRIPK1キナーゼ活性の重要な役割を明らかにしました。彼らの研究を通じて、RIPK1^K45Aの変異は、サイトカイン産生の低下、RIPK1およびMLKLタンパク質のリン酸化の減少、ならびにリポ多糖体(LPS)と細胞透過性パンカスパーゼ阻害因子(zVAD)の組み合わせ、ならびに腫瘍壊死因子α(TNFα)およびzVADを含む処理後の細胞生存率の上昇をもたらすことが観察されました。LPS/zVAD処理を用いてマクロファージのネクロトーシスを誘導し、マクロファージをzVADとともにLPSに曝露させました。同様に、TNFα/zVAD処理では、炎症性サイトカインであるTNFαをzVADと併用してマクロファージのネクロトーシスを誘導しました。

さらに、本研究では、TNFαシグナル伝達に対するRIPK1の調節的影響と、マクロファージ炎症性タンパク質-1α(MIP-1α)およびインターロイキン-1α(IL-1α)の転写調節へのRIPK1の関与を明らかにしました。また、本研究では、カスパーゼ-8阻害薬インヒビターは、特にp38MAPKパスウェイが抑制された場合に、マクロファージにおけるネクロトーシスの発生を高めるという興味深い観察も報告されています。

この研究により、RIPK1 のリジン 45 が、RIPK1 の自己リン酸化と、LPS や TNF-α などのさまざまな刺激によって誘導されるマクロファージの細胞死に必要であることが示されました。RIPK1K45A マクロファージは、これらの刺激によって誘発される細胞死に対して耐性があり、LPS/ZVAD および TNF-α/ZVAD 処理に応答して STAT1 のリン酸化の減少を示しました。これらの結果は、RIPK1K45A が TNF-R 結合の下流での細胞死の制御に関与しており、さまざまな刺激に応答した過剰な細胞死の防止に役割を果たしていることが示唆されています。

この研究では、RIPK3のリン酸化がRIPK1K45Aマクロファージにおいて減弱されることが示され、このキナーゼドメインがマクロファージのネクロトーシスを促進する上で重要な役割を果たすことが示唆されました。RIPK3抗体を用いてRIPK3のレベルを同定して測定し、RIPK3とRIPK1およびMLKLとの相互作用をウェスタンブロットにより測定しました。これらの結果により、RIPK3抗体がRIPK1キナーゼ活性の特徴付け、およびマクロファージにおけるネクロトーシス、炎症反応、およびサイトカインシグナル伝達の調節におけるその役割の研究に非常に有用であることが示されました。

最後に

これらの研究は、マウス胎児線維芽細胞 (MEF) におけるPS曝露とネクロトーシスの開始における RIPK3、MLKL、および IFN-γ の役割についての重要な考察を提供しました。さらに、IFN-γを介したPS曝露、およびネクロトーシスパスウェイにおけるRIPK3とMLKLの重要な役割も示唆されています。

また、RIPK1の変異、特にRIPK1K45Aは、マクロファージのネクロトーシスと炎症反応の開始を阻害します。この研究では、マクロファージ内のネクロトーシスおよびサイトカインシグナル伝達の開始におけるRIPK1キナーゼドメインの役割と、それに続くin vivo炎症反応に対する影響が強調されています。 今回紹介した論文では、ProSci社ウサギ抗RIPK3抗体を用いて、異なる細胞株におけるRIPK3の発現が検討されました。RIPK1キナーゼ活性と、マクロファージにおけるネクロトーシス、炎症反応、サイトカインシグナル伝達におけるその調節機能を明らかにする上で重要な役割を果たしていることが示されました。これらの研究の結果は、PS曝露とネクロトーシスのプロセスにおけるRIPK3とMLKLの機能に関するさらなる研究を促進する可能性があり、それによって免疫系における細胞死の根底にある機構の理解を深め、がんや感染症などの疾患におけるネクロトーシスを標的とする新しい治療戦略の開発につながることが期待されます。