　2023年8月5日（土）、摂南大学農学部8号館にて公開講座が開催されました。小学生から社会人まで、幅広い層の25名が参加しました。

　私たちが普段食べている野菜は、形や色が様々です。キャベツとレタス、大根とニンジンは形が似ている一方、紫キャベツとナスは色が似ています。しかし、見た目だけでは野菜の類縁関係を判断するのは難しいものです。

　この講座では、こうした身近な野菜を使い、DNA分析とコンピュータ、データベースによる遺伝情報解析をおこなうことで、野菜の類縁関係を調べました。また、野生の植物としての野菜のルーツも解析し、その進化の過程にふれました。

講師紹介

　この講座の講師陣は、摂南大学農学部応用生物科学科の椎名隆教授、加藤裕介准教授、石崎陽子助手です。皆さん、植物分子生物学のプロフェッショナルとして活躍されています。

　また、摂南大学の4回生3名、3回生3名のティーチングアシスタント（TA）の方がサポートに加わり、受講者の実験を支えてくれました。

椎名先生

普段食べている野菜に、どのような遺伝的なつながりがあるのかを、科学的な手法を学びながら知ってもらえたら嬉しいです。そして、DNAを通じて、野菜がどのように進化してきたのかをひも解いていきましょう。遺伝学的な視点から身近な野菜をみる楽しさ、そして知る喜びを一緒に味わいましょう！

実験

ウォーミングアップ：野菜を仲間に分けてみよう

　実験の前に野菜の形やルーツに関する解説が行われました。その後、参加者は1人ずつ野菜を7つのグループに分け、簡単な自己紹介とともに、なぜそのように分類したのかをチームで話しました。また、DNA塩基配列を手がかりにすると、どのようにグループ分けが変わるのかを予想しました。

椎名先生

科学は、仮説を立て、それを確かめていく中で多くの発見が生まれます。「この野菜はこの仲間かもしれない」という予想が、実験結果との違いを際立たせ、新しい発見につながります。予想を立てながら実験に取り組みましょう。

実験1：野菜からのDNA抽出とPCR反応

　実験1では、野菜からDNAを抽出し、それをPCR反応で増幅します。細胞は糖類、脂質、たんぱく質、DNA、RNAなどで構成されていますが、DNAを正確に分析するためには、DNA以外の成分を取り除き、純粋なDNAを抽出する必要があります。

　はじめに、-196℃の液体窒素で野菜を凍らせて粉砕し、DNA抽出バッファーでDNAを含む成分を水に溶かします。次に、タンパク質変性剤を使ってタンパク質や糖類を除去し、最後はカラム（DNAを吸着する樹脂）を通過させて不純物を取り除き、きれいなDNA溶液を得ます。この抽出したDNAは、特定の領域を数百万倍に増幅するPCR反応に使います。

解析する野菜リスト

　これらの野菜を対象に解析をおこないます。

使用する器具

1.5 ml マイクロチューブ、遠心分離機（遠心機）、ヒートブロック（65℃）、ボルテックス、乳鉢、乳棒、乳鉢マット、液体窒素を入れるサーモカップ、薬さじ（スパテル）、マジックペン、チューブ立て、ピンセット、紫色カラム、緑色カラム、軍手

使用する試薬

DNA抽出バッファーPL1、バッファーPC、洗浄液PW1、洗浄液PW２、溶出液PE

実験1-1 ：野菜からDNAを抽出する

① 野菜サンプル（以降、サンプル）の準備：葉物野菜は 3 cm× 3 cmに切り、根菜類は薄くスライスする。

② サンプルの粉砕：乳鉢に液体窒素を入れて冷やし、その中に約 100 mg のサンプルをいれ、再度液体窒素をいれて凍らせ、乳棒ですりつぶして粉末にする。

椎名先生

液体窒素は非常に冷たいので、利き手と反対の手に軍手をはめて乳鉢を持ちましょう。液体窒素がほぼ蒸発したタイミングが、サンプルをつぶしやすいですよ。

③ DNAの抽出：粉末状にしたサンプルを冷やした薬さじでエッペンドルフチューブに移し、400 μl のDNA抽出バッファー（PL1）を加える。その後、ボルテックスミキサーで均一になるまで（約30秒）混ぜる。

椎名先生

②と③のステップを手早く行うことで、より多くのDNAを抽出できます。ここはスピードを意識して進めてみましょう！

④ 酵素処理：TAの方にRNA分解酵素（RNaseA）を 10 μl 加えてもらい、再度ボルテックスミキサーで均一になるまで混ぜる。その後、ヒートブロックを65℃に設定し、10分間加温する。

⑤ 遠心分離：12,000 rpm で5分間、室温で遠心する。

⑥ 濾過：遠心後、DNAが含まれる上清をP200のマイクロピペットで紫色のカラム（Nucleo Spinfilter）に移し、12,000 rpm で2分間遠心する。その後、中のカラムを外して廃棄し、通過した液体（DNAを含む）を新しいエッペンドルフチューブに 150 μl × 2 で移す。

椎名先生

マイクロピペットで上清を吸い取る際には、沈殿を吸わないように注意しましょう。沈殿には不要なタンパク質や多糖類、脂質が含まれています。また、カラムを通過した液にはDNAが含まれているので、下の液体が重要です。

⑦ 洗浄：バッファーPC 450 μl を加え、ボルテックスミキサーで混ぜた後、700 μl を緑色のカラム（NucleoSpin Plant II Column）に入れ、12,000 rpmで1分間遠心する。この工程でDNAが中のカラムに付着する。その後、カラムの下にたまった液（フロースルー）はDNA以外の夾雑物（きょうざつぶつ：ゴミ）が含まれているため、廃棄する。再度カラムをチューブに差し込み、洗浄液PW1 400 μl を加えて、12,000 rpm で1分間遠心し、DNAを洗浄する。同様に洗浄液PW2 700 μl を使用して洗浄し、さらにPW2 200 μl で最終洗浄をおこなう。

⑧ DNAの溶出：溶出液PE 50 μl をカラムに加え、65℃で5分間静置した後、12,000rpmで1分間遠心する。遠心後、中のカラムを廃棄し、エッペンドルフチューブに残った溶液にDNAが含まれる。

椎名先生

溶出液を加えて静置することで、カラムに付着したDNAが溶け出します。遠心後、溶け出したDNAはエッペンドルフチューブに集まり、最終的に溶液として回収できます。

実験1-2：PCR反応でDNAを増幅する

　次に、DNA抽出液を使用してPCR反応を行います。PCR反応では、特定のDNA領域を選び、数億〜数十億塩基対の中から数百塩基対の特異的な短い領域（バーコーディング部位）を数百万倍に増幅します。

　ここでの作業はTAの方が担当し、受講者はその様子を見学しました。DNA抽出液とPCR反応液を混合したPCRチューブをサーマルサイクラー（PCR反応を起こすための機器）にセットし、反応を実施しました。

椎名先生

PCRで増幅させるDNAの領域は、野菜の葉緑体ゲノムの trnL-trnF 遺伝子間領域です。

▼PCRについて詳しく知りたい方はこちら

実験2：増幅したDNA断片を電気泳動で確認後、塩基配列を調べる

　PCRで増幅したDNA断片のサイズを確認するために、電気泳動法を使って分離を行いました。電気泳動では、DNA分子が持つ負の電荷を利用し、電流を流すことでDNA断片を大きさごとに分けます。

　まず、アガロース（寒天）ゲルを準備し、PCRで得られたDNAサンプルをゲルにあけたくぼみ（ウェル）に注入します。DNAは無色の分子ですが、特定の蛍光色素を使うことで目に見える形にすることができます。

　DNAの断片は、ゲル中を移動する際、大きな断片ほど移動が遅く、小さな断片は早く移動します。これにより、異なるサイズのDNA断片を分離することができます。

椎名先生

電気泳動によって増幅されたDNA断片の長さを確認します。分子量マーカー（サイズを測る目安となるDNA断片）を比較に使い、結果を読み取りましょう。

▼電気泳動について詳しく知りたい方はこちら

実験に使用する器具・試薬

PCR産物、必ずバンドが見えるポジティブコントロール試料、電気泳動槽、TAEバッファー、練習用アガロースゲル、アプライ練習用サンプル、本番用アガロースゲル、マイクロピペット、チップ、撮影装置、分子量マーカー（コスモ・バイオ社寄贈品：FastRunner DNA Ladder）

実験2-1：電気泳動

① PCRチューブに入ったPCR産物をチビタンで軽く下に落とす。

② ポジティブコントロール試料から 5 μl を吸い取り、ウェル（ゲルにあけられた穴）に注入する。

③ 調べたい他の試料（PCR産物）も同様に 5 μl をウェルに注入する。

④ 分子量マーカー 5 μl も、同じようにウェルに注入する。

⑤ 電気泳動を行い、色素がゲルの3分の2あたりに達するまで約15〜25分間泳動する。

⑥ 泳動が終了したら、撮影装置を使って結果を撮影する。

実験2-2：塩基配列の解析 – シークエンシング –

　PCR反応物の残りを精製し、シークエンスプライマー（DNAの特定の領域を読み取るための開始点となる短いDNA断片）を加えた後、シークエンシングを委託業者に依頼します。業者はサンガー法を用いてDNAの正確な塩基配列を解析し、翌日にはその結果が提供されます。

　具体的には、シークエンシング結果を使用して、実験3で行う相同性検索（DNAやタンパク質の配列をデータベースと照合し、類似する遺伝子や生物を探すこと）や、類似度検索（配列間の類似度を計算し、進化的な近さを数値で示すこと）を行います。これらの結果を基に、最終的に系統樹を作成し、野菜の遺伝的な関係を可視化します。

　今回は時間の都合上、事前に調べておいたDNA配列データを使用して実験3（後編に掲載）に進みました。